Obiettivi formativi
Al termine del corso, lo studente dovrebbe avere appreso le tecniche di base per manipolare in vitro le tre principali macromolecole biologiche: DNA, RNA e Proteine. Il corso si propone inoltre di insegnare le varie strategie utilizzate nel clonaggio genico in microrganismi e nell’espressione di proteine ricombinanti in batteri.
In particolare lo studente dovrebbe essere in grado di:
D1. Capire e conoscere le modalità di amplificazione in vitro, in vivo e per sintesi chimica delle tre classi principali di macromolecole biologiche: DNA, RNA e Proteine. Apprendere la composizione e le modalità di replicazione di differenti tipi di vettori in batterio. Comprendere i meccanismi chimici e fisici alla base delle tecnologie ricombinanti. (Conoscenza e capacità di comprensione)
D2. Capacità di progettare la strategia più corretta per realizzare il clonaggio genico all’interno di un vettore batterico. Definire le metodologie analitiche per controllare l’avvenuto clonaggio genico, nonché stabilire possibili esperimenti di controllo. (Capacità di applicare conoscenza e comprensione)
D3. Saper valutare la metodologia migliore per eseguire il clonaggio genico o l’espressione di proteine ricombinanti. (Autonomia di giudizio)
D5. Essere in grado di esporre i risultati di un esperimento di tecnologie ricombinanti anche ad un pubblico non esperto. (Abilità comunicative)
D5. Saper collegare i meccanismi molecolari appresi durante i corsi di Biochimica e di Biologia Molecolare con le metodologie applicative del DNA ricombinante. Aggiornarsi su tecniche innovative mediante la consultazione delle pubblicazioni scientifiche. (Capacità di apprendimento)
Prerequisiti
No
Contenuti dell'insegnamento
Durante il corso verranno affrontati i seguenti argomenti:
1. Enzimi· Enzimi di Restrizione· Metilazione del DNA· Ligasi· DNA polimerasi· Trascrittasi Inversa (DNA polimerasi RNA dipendente)· Terminal Transferase· RNA polimerasi· Polinucleotide kinasi del fago T4· Fosfatasi alcaline· Nucleasi
2. Elettroforesi su gel · Elettroforesi su gel di agarosio· Recupero del DNA dal gel· Elettroforesi su gel di poliacrilamide · Recupero del DNA dal gel.
3. Clonaggio di singoli geni. Batteri· Terreni di crescita· Genotipo· Conservazione e propagazione. Plasmidi batterici· Replicazione e Incompatibilità· Mobilità· Marcatori di Selezione· Sviluppo dei plasmidi come vettori di clonaggio· Purificazione del DNA e dell’RNA· Determinazione della concentrazione e della purezza. Estrazione e purificazione del DNA plasmidico dai batteri· Digestione con enzimi di restrizione· Purificazione dei prodotti di digestione · Ligazione· Trasformazione dei batteri· Identificazione delle colonie batteriche contenenti plasmidi ricombinanti· Identificazione del ricombinante di interesse· Amplificazione e conservazione dei cloni e librerie plasmidiche.
4. Costruzione ed analisi di librerie. Vettori ad alta capacità usati per librerie· Batteriofagi lambda· Cosmidi· Batteriofagi filamentosi a singolo filamento· Fagemidi· Analisi e clonaggio di DNA genomico eucariotico· Isolamento di DNA genomico eucariotico· Frammentazione del DNA genomico· Dimensione di una libreria genomica· Costruzione ed analisi di librerie a cDNA. Estrazione e purificazione dell’RNA· Preparazione dei materiali e delle soluzioni utilizzati nelle estrazioni di RNA· Metodi classici di estrazione· Separazione del Poli(A)+RNA. Dimensioni di una libreria di cDNA· Sintesi del primo filamento del cDNA· Sintesi del secondo filamento del cDNA· Clonaggio del cDNA in un vettore· Screening di una libreria· Screening mediante ibridazione di acidi nucleici· Screening immunologico· Screening funzionale· Screening per interazione.
5. Sintesi in vitro di DNA. Sintesi artificiale di DNA. PCR· Componenti essenziali della PCR· Fasi termiche della PCR· Progettazione dei primer· Problema delle contaminazioni· Hot start · Analisi per elettroforesi su gel· Clonaggio degli ampliconi· Nested PCR· Long PCR· Reverse Transcriptase-PCR (RT-PCR)· Touchdown PCR. Mutagenesi per PCR.
6. Sequenziamento· Metodo di Sanger · Sequenziamento automatico · Sequenziamento di prodotti di PCR · Sequenziamento di frammenti di DNA lunghi e di interi genomi.
7. Produzione di proteine ricombinanti. Trascrizione di proteine ricombinanti · Regolazione della trascrizione di proteine ricombinanti · Traduzione e stabilità proteica · Vettori · Purificazione della proteina ricombinante.
Programma esteso
1. Enzimi· Enzimi di Restrizione· Metilazione del DNA· Ligasi· DNA polimerasi· Trascrittasi Inversa (DNA polimerasi RNA dipendente)· Terminal Transferase· RNA polimerasi· Polinucleotide kinasi del fago T4· Fosfatasi alcaline· Nucleasi
2. Elettroforesi su gel · Elettroforesi su gel di agarosio· Recupero del DNA dal gel· Elettroforesi su gel di poliacrilamide · Recupero del DNA dal gel.
3. Clonaggio di singoli geni. Batteri· Terreni di crescita· Genotipo· Conservazione e propagazione. Plasmidi batterici· Replicazione e Incompatibilità· Mobilità· Marcatori di Selezione· Sviluppo dei plasmidi come vettori di clonaggio· Purificazione del DNA e dell’RNA· Determinazione della concentrazione e della purezza. Estrazione e purificazione del DNA plasmidico dai batteri· Digestione con enzimi di restrizione· Purificazione dei prodotti di digestione · Ligazione· Trasformazione dei batteri· Identificazione delle colonie batteriche contenenti plasmidi ricombinanti· Identificazione del ricombinante di interesse· Amplificazione e conservazione dei cloni e librerie plasmidiche.
4. Costruzione ed analisi di librerie. Vettori ad alta capacità usati per librerie· Batteriofagi lambda· Cosmidi· Batteriofagi filamentosi a singolo filamento· Fagemidi· Analisi e clonaggio di DNA genomico eucariotico· Isolamento di DNA genomico eucariotico· Frammentazione del DNA genomico· Dimensione di una libreria genomica· Costruzione ed analisi di librerie a cDNA. Estrazione e purificazione dell’RNA· Preparazione dei materiali e delle soluzioni utilizzati nelle estrazioni di RNA· Metodi classici di estrazione· Separazione del Poli(A)+RNA. Dimensioni di una libreria di cDNA· Sintesi del primo filamento del cDNA· Sintesi del secondo filamento del cDNA· Clonaggio del cDNA in un vettore· Screening di una libreria· Screening mediante ibridazione di acidi nucleici· Screening immunologico· Screening funzionale· Screening per interazione.
5. Sintesi in vitro di DNA. Sintesi artificiale di DNA. PCR· Componenti essenziali della PCR· Fasi termiche della PCR· Progettazione dei primer· Problema delle contaminazioni· Hot start · Analisi per elettroforesi su gel· Clonaggio degli ampliconi· Nested PCR· Long PCR· Reverse Transcriptase-PCR (RT-PCR)· Touchdown PCR. Mutagenesi per PCR.
6. Sequenziamento· Metodo di Sanger · Sequenziamento automatico · Sequenziamento di prodotti di PCR · Sequenziamento di frammenti di DNA lunghi e di interi genomi.
7. Produzione di proteine ricombinanti. Trascrizione di proteine ricombinanti · Regolazione della trascrizione di proteine ricombinanti · Traduzione e stabilità proteica · Vettori · Purificazione della proteina ricombinante.
Bibliografia
Dai geni ai genomi - Dale, von Schantz - EdiSES
Analisi dei geni e genomi - Richard J.Reece - EdiSES
Ingegneria genetica. Principi e tecniche. S.Primrose et al. - Zanichelli
DNA Ricombinante - J.D.Watson et al. - Zanichelli
Biotecnologie Molecolari. Principi e tecniche -Terry A.Brown - Zanichelli
Metodi didattici
Il corso sarà costituito da lezioni frontali con l’utilizzo di diapositive proiettate. A causa dell’emergenza Covid, le lezioni saranno erogate in modalità mista cioè in aula con una parte di studenti in presenza (su prenotazione) e in contemporanea in diretta streaming per gli studenti a casa. Durante il corso verranno proposti esercizi, in cui gli studenti potranno applicare le varie procedure acquisite. Il materiale didattico, con esempi di esercizi, e tutte le lezioni registrate verranno resi disponibili sulla piattaforma Elly.
Modalità verifica apprendimento
Le modalità di verifica dell'apprendimento prevedono un esame scritto costituito da 5 esercizi/domande aperte in cui sarà valutato il livello delle conoscenze teoriche disciplinari e la capacità di applicazione di tali conoscenze da parte dello studente. Gli studenti possono visionare l’esame, previo appuntamento con il docente. Il voto verrà calcolato come media aritmetica dei voti ottenuti nei singoli esercizi/domande aperte.
Altre informazioni
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Obiettivi agenda 2030 per lo sviluppo sostenibile
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