Obiettivi formativi
Il corso ha come obiettivo principale la comprensione degli aspetti biochimici fondamentali degli acidi nucleici. Particolare attenzione verrà rivolta alla comprensione degli elementi di struttura del DNA sulla base dei quali verranno spiegate le peculiari caratteristiche di stabilità, contenuto informazionale e leggibilità del materiale genetico. Verranno quindi analizzati in modo approfondito i meccanismi molecolari alla base dei processi di replicazione, riparazione, ricombinazione, trascrizione e traduzione del DNA. Buona parte del corso sarà dedicata alla comprensione delle strategie regolative fondamentali operanti nei batteri e nei fagi e le loro possibili implicazioni per il controllo dell’espressione genica in organismi più complessi. Il corso si conclude con l’introduzione alle principali tecniche di biologia molecolare quali il clonaggio, la PCR e il sequenziamento del DNA.
Prerequisiti
Per una migliore comprensione del corso è indispensabile che lo studente conosca i principi di base della chimica e della biochimica e della genetica.
Contenuti dell'insegnamento
STRUTTURA DEGLI ACIDI NUCLEICI
Proprietà del materiale genetico: il principio trasformante, la scoperta di Avery, la regola di Chargaff; proprietà chimico-fisiche dei nucleotidi; modificazioni chimiche, protonazione e tautomeria cheto-enolica delle basi azotate; la struttura primaria del DNA; la termodinamica del legame fosfodiesterico; legami deboli e legami forti; la doppia elica e l’appaiamento delle basi secondo il modello di Watson e Crick; la replicazione semi-conservativa del DNA; strutture secondarie alternative del DNA (DNA A, DNA Z, DNA H); sequenze ripetute dirette, invertite e speculari; e curvatura intrinseca del DNA; elementi strutturali di riconoscimento del DNA (read-out); interazioni specifiche DNA-proteina; stabilità della doppia elica: fusione e rinaturazione del DNA; struttura primaria, secondaria e caratteristiche distintive dell’RNA; idrolisi alcalina dell'RNA e meccanismo d'azione della RNasi A; elementi di topologia: superavvolgimento, numero di legame e variazioni conformazionali del DNA; topoisomerasi I e II; compattamento degli acidi nucleici: gli istoni, il nucleosoma, le fibre e le strutture di ordine superiore della cromatina.
REPLICAZIONE DEL DNA
Schema generale della replicazione: termodinamica e meccanismo di sintesi del DNA; struttura del sito attivo della DNA polimerasi; processività e sliding clamp; attività di proof-reading della DNA polimerasi; sintesi semidiscontinua del DNA: filamento continuo, filamento ritardato, frammenti di Okazaki e rimozione degli inneschi; meccanismo d'azione della DNA ligasi; origini di replicazione; DNA polimerasi III, struttura e assemblaggio del replisoma; DNA primasi, DNA elicasi, DNA topoisomerasi e altre proteine coinvolte nella replicazione; replicazione bidirezionale del genoma di E. coli; replicazione dei genomi eucariotici; il problema delle estremità del DNA.
RIPARAZIONE DEL DNA; TRASCRIZIONE
Struttura generale di geni e operoni procariotici; promotori batterici: le regioni -10 e -35, gli elementi UP, l’elemento -10 esteso; struttura della RNA polimerasi batterica; il fattore sigma; schema generale del processo trascrizionale: inizio, allungamento, terminazione. La trascrizione negli eucarioti: promotori, il complesso di pre-inizio, il mediatore, la RNA polimerasi II; capping e poliadenilazione dell'RNA; le RNA polimerasi I e III.
LO SPLICING DELL’RNA
Introni, esoni e processamento post-trascrizionale dei trascritti primari; la chimica dello splicing; lo spliceosoma; splicing degli introni di gruppo I e II; lo splicing alternativo; editing dell’RNA; trasporto dell’mRNA fuori dal nucleo.
LA TRADUZIONE
Il codice genetico; REGOLAZIONE GENICA NEI PROCARIOTI
Principi generali della regolazione trascrizionale; NtrC, operone triptofano (TrpR) e attenuazione; regolazione trascrizionale e la scelta lisi-lisogenia nel fago lambda; struttura e funzione dei repressori cI e cro; cooperatività nel legame del repressore; controllo trascrizionale positivo e negativo, antiterminazione, regolazione antisenso. Integrazione e escissione del fago lambda mediante ricombinazione sito-specifica.
TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE.
Programma esteso
STRUTTURA DEGLI ACIDI NUCLEICI
Proprietà del materiale genetico: il principio trasformante, la scoperta di Avery, la regola di Chargaff; proprietà chimico-fisiche dei nucleotidi; modificazioni chimiche, protonazione e tautomeria cheto-enolica delle basi azotate; la struttura primaria del DNA; la termodinamica del legame fosfodiesterico; legami deboli e legami forti; la doppia elica e l’appaiamento delle basi secondo il modello di Watson e Crick; la replicazione semi-conservativa del DNA; strutture secondarie alternative del DNA (DNA A, DNA Z, DNA H); sequenze ripetute dirette, invertite e speculari; e curvatura intrinseca del DNA; elementi strutturali di riconoscimento del DNA (read-out); interazioni specifiche DNA-proteina; stabilità della doppia elica: fusione e rinaturazione del DNA; struttura primaria, secondaria e caratteristiche distintive dell’RNA; idrolisi alcalina dell'RNA e meccanismo d'azione della RNasi A; elementi di topologia: superavvolgimento, numero di legame e variazioni conformazionali del DNA; topoisomerasi I e II; compattamento degli acidi nucleici: gli istoni, il nucleosoma, le fibre e le strutture di ordine superiore della cromatina.
REPLICAZIONE DEL DNA
Schema generale della replicazione: termodinamica e meccanismo di sintesi del DNA; struttura del sito attivo della DNA polimerasi; processività e sliding clamp; attività di proof-reading della DNA polimerasi; sintesi semidiscontinua del DNA: filamento continuo, filamento ritardato, frammenti di Okazaki e rimozione degli inneschi; meccanismo d'azione della DNA ligasi; origini di replicazione; DNA polimerasi III, struttura e assemblaggio del replisoma; DNA primasi, DNA elicasi, DNA topoisomerasi e altre proteine coinvolte nella replicazione; replicazione bidirezionale del genoma di E. coli; replicazione dei genomi eucariotici; il problema delle estremità del DNA.
RIPARAZIONE DEL DNA
Mutazioni puntiformi; danno idrolitico e modificazioni chimiche delle basi azotate; il test di Ames; riparazione dei mismatch; riparazione per fotoriattivazione; riparazione per escissione di basi; riparazione per escissione nucleotidica; riparazione per ricombinazione omologa; sintesi del DNA per translesione; induzione della risposta SOS.
TRASCRIZIONE
Struttura generale di geni e operoni procariotici; promotori batterici: le regioni -10 e -35, gli elementi UP, l’elemento -10 esteso; struttura della RNA polimerasi batterica; il fattore sigma; schema generale del processo trascrizionale: inizio, allungamento, terminazione. La trascrizione negli eucarioti: promotori, il complesso di pre-inizio, il mediatore, la RNA polimerasi II; capping e poliadenilazione dell'RNA; le RNA polimerasi I e III.
LO SPLICING DELL’RNA
Introni, esoni e processamento post-trascrizionale dei trascritti primari; la chimica dello splicing; lo spliceosoma; splicing degli introni di gruppo I e II; lo splicing alternativo; editing dell’RNA; trasporto dell’mRNA fuori dal nucleo.
TRADUZIONE
Il codice genetico; struttura dell’RNA messaggero (mRNA); struttura dell’RNA transfer (tRNA); legame degli amminoacidi al tRNA; le amminoacil-tRNA sintetasi; il ribosoma; formazione del legame peptidico; meccanismo molecolare e fasi funzionali della traduzione: inizio, allungamento, terminazione; fedeltà ed energetica della traduzione; il problema degli RNA spezzati.
REGOLAZIONE GENICA NEI PROCARIOTI
Principi generali della regolazione trascrizionale; regolazione positiva e negativa della trascrizione; azione a distanza; operone lattosio: LacI, Cap; fattori sigma alternativi; NtrC, operone triptofano (TrpR) e attenuazione; regolazione trascrizionale e la scelta lisi-lisogenia nel fago lambda; struttura e funzione dei repressori cI e cro; cooperatività nel legame del repressore; controllo trascrizionale positivo e negativo, antiterminazione, regolazione antisenso. Integrazione e escissione del fago lambda mediante ricombinazione sito-specifica.
TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE
La reazione a catena della polimerasi (PCR); il sequenziamento del DNA secondo il metodo di Sanger.
Bibliografia
BIOLOGIA MOLECOLARE - Principi di funzionamento del genoma
Craig, Cohen-Fix, Green, Greider, Storz, Wolberger. Pearson
I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER Quinta edizione - autore David Nelson e Michael Cox, casa ed. Zanichelli
REGOLAZIONE GENICA - autore Mark Ptashne, casa ed. Zanichelli
Understanding DNA - autore Calladine, case ed. Academic Press Terza edizione
Metodi didattici
Lezione frontale
Modalità verifica apprendimento
La valutazione dei risultati di apprendimento attesi si basa su una prova scritta ed una relazione orale nella quale gli studenti dovranno descrivere dal punto di vista strutturale e funzionale una proteina assegnata. La relazione orale potrà essere sostenuta solo dopo il superamento della prova scritta. La prova scritta, da svolgersi in un tempo massimo di due ore, si compone di sei domande atte a valutare il grado di apprendimento e di analisi critica degli argomenti trattati.
Altre informazioni
Orario delle lezioni, materiale didattico, appelli sono consultabili al sito web:
http://scienzebiologiche.unipr.it/cgi-bin/campusnet/corsi.pl/Show?_id=0db5
Obiettivi agenda 2030 per lo sviluppo sostenibile
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