Obiettivi formativi
Il corso intende fornire gli strumenti metodologici rivolti alla risoluzione di miscele di proteine e acidi nucleici e alla determinazione qualitativa e quantitativa di specifiche componenti di interesse nella diagnostica alimentare, basati sulle tecniche separative cromatografiche ed elettroforetiche, sulle tecniche di sequenziamento di proteine e DNA e sulle diverse tecniche immunologiche e di biologia molecolare. Sono inoltre descritte le tecniche di biologia molecolare utilizzate per l'ottenimento di organismi transgenici e di proteine ricombinanti di interesse nel settore agro-alimentare. Ampio risalto è dato agli enzimi e alle loro applicazioni analitiche e tecnologiche nell’ambito alimentare.
Contenuti dell'insegnamento
Determinazione della composizione amminoacidica delle proteine. Frammentazione delle proteine in peptidi. Separazione cromatografica, sequenziamento (Degradazione di Edman) e allineamento dei peptidi. Identificazione delle proteine mediante sequenziamento dell’estremità N-terminale e mediante analisi di banche-dati di sequenze di proteine e DNA.
o Metodi separativi utilizzati per le proteine. Precipitazione differenziata delle proteine mediante modificazioni di pH, forza ionica e costante dielettrica del mezzo. Tecniche separative cromatografiche per le proteine: cromatografie ad interazione idrofobica, a scambio ionico, ad esclusione dimensionale e di affinità/immunoaffinità. Tecniche separative elettroforetiche per le proteine: elettroforesi su gel di poliacrilammide (SDS-PAGE); focalizzazione isoelettrica; elettroforesi bidimensionale.
o Metodologie immunochimiche. Cenni alle basi biochimiche della risposta immunitaria e alle proprietà strutturali/funzionali degli anticorpi. Preparazione di anticorpi policlonali e monoclonali. Utilizzazione degli anticorpi come reagenti analitici: immunoprecipitazione, immunodiffusione, immunoelettroforesi, Western Blotting, test immunoenzimatici (ELISA).
o Metodologie di biologia molecolare. Elettroforesi di acidi nucleici. Enzimi impiegati per la manipolazione del DNA: DNA polimerasi, nucleasi, ligasi. Sequenziamento del DNA: metodo della degradazione chimica e metodo a terminazione di catena; sequenziamento a ciclo termico, uso di primer fluorescenti per sequenziamenti automatizzati. Fusione e rinaturazione del DNA. PCR e RT-PCR (reazioni a catena della DNA polimerasi) qualitative e quantitative (real time PCR), RAPD. Enzimi di restrizione e RFLP. Clonazione di geni esogeni, trasformazione di organismi ospiti e selezione dei ricombinanti. Cenni alle metodologie impiegate nella preparazione di organismi transgenici e di proteine ricombinanti di interesse nel settore agro-alimentare. Mais Bt e soia RoundUp ready. Metodi di analisi per la presenza di OGM autorizzati e non autorizzati in prodotti alimentari.
o Enzimologia e sue applicazioni. Meccanismo d’azione degli enzimi: principali fattori della catalisi enzimatica. Cinetica enzimatica allo stato stazionario e determinazione di kcat, Km e kcat/Km. Tecnologia degli enzimi. a) Impiego degli enzimi a fini analitici. b) Applicazioni tecnologiche degli enzimi al settore alimentare. Degradazione dell’amido in zuccheri (amilasi e glucosio isomerasi), tecnologie lattiero-casearie (chimosina, proteasi, lipasi, lattasi, lisozima), sintesi di aspartame (termolisina), risoluzione di D- e L-amminoacidi (amminoacilasi). c) Inibitori enzimatici. Inibitori reversibili e irreversibili. Pesticidi come inibitori enzimatici. d) Denaturazione e stabilizzazione degli enzimi. Meccanismo d'azione di agenti chimico-fisici con attività denaturante. Analisi del "folding"/"unfolding" delle proteine mediante l'impiego di tecniche spettroscopiche. Preparazione di enzimi stabili: fissazione covalente e non covalente a supporto. Enzimi da microrganismi termofili.
o Basi biochimiche della BSE.
Bibliografia
Wilson K., Walker J. Metodologia Biochimica. Raffaello Cortina Editore
Ninfa A.J., Ballou D.P. Metodologie di base per la biochimica e la biotecnologia. Zanichelli Editore.
Metodi didattici
Lezioni orali mediante l'impiego di mezzi multimediali.
Modalità verifica apprendimento
Esame scritto seguito dalla discussione delle risposte scritte.
