Obiettivi formativi
Il corso si propone di introdurre le tecniche di base di biologia molecolare utilizzate nell'isolamento e clonaggio di geni, e nella espressione di proteine ricombinanti in un ospite batterico
Prerequisiti
No
Contenuti dell'insegnamento
1. Enzimi• Enzimi di Restrizione• Metilazione del DNA•Ligasi• DNA polimerasi• Trascrittasi Inversa (DNA polimerasi RNA dipendente)•Terminal Transferase• RNA polimerasi• Polinucleotide kinasi del fago T4•Fosfatasi alcaline• Nucleasi
2. Purificazione del DNA e dell’RNA• Lavaggi con Fenolo, Fenolo-Cloroformio, Cloroformio• Precipitazione con Alcol ed essicamento • Risospensione in TE o acqua• Determinazione della concentrazione e della purezza
3. Batteri• Terreni di crescita• Genotipo• Conservazione e propagazione
4. Plasmidi batterici• Replicazione e Incompatibilità• Mobilità• Marcatori di Selezione• Sviluppo dei plasmidi come vettori di clonaggio• Estrazione e purificazione del DNA plasmidico dai batteri• Digestione con enzimi di restrizione• Purificazione dei prodotti di digestione • Ligazione• Strategie di ligazione di un DNA esogeno in un vettore plasmidico• Trasformazione dei batteri• Identificazione delle colonie batteriche contenenti plasmidi ricombinanti• Identificazione del ricombinante di interesse• Possibili risultati di una ligazione + trasformazione• Controlli sulla ligazione + trasformazione • Amplificazione e conservazione dei cloni e librerie plasmidiche
5. Batteriofagi lambda• Biologia molecolare del batteriofago lambda• Costruzione dei vettori basati sul batteriofago lambda• Titolazione dei batteri• Titolazione dei fagi• Estrazione e purificazione del DNA fagico • Preparazione di fagi ricombinanti• Identificazione delle placche che contengono fagi ricombinanti• Amplificazione e conservazione dei cloni o delle librerie fagiche
6. Cosmidi• Caratteristiche dei cosmidi• Costruzione di librerie genomiche incosmidi• Amplificazione e conservazione dei cloni o delle librerie cosmidiche
7. Batteriofagi filamentosi a singolo filamento• Biologia molecolare dei batteriofagi filamentosi• Clonazione nella regione intergenica della RF • Trasformazione e formazione delle placche• Identificazione delle placche che contengono fagi ricombinanti• Estrazione e purificazione del DNA fagico • Moltiplicazione dei fagi in terreno liquido • Purificazione del DNA fagico (PEG + Fenolo-cloroformio)• Amplificazione e conservazione dei cloni
8. Fagemidi • Caratteristiche dei Fagemidi• Clonaggio nei Fagemidi • Produzione del DNA a filamento singolo mediante Fago Helper• Costruzione di librerie a cDNA in fagemidi • lambda-ZAP: caratteristiche• Clonaggio e recupero del plasmide
9. Elettroforesi su gel • Elettroforesi su gel di agarosio• Recupero del DNA dal gel• Gel di agarosio denaturante (alcalini, formaldeide)• Elettroforesi su gel di poliacrilamide non denaturante• Elettroforesi su gel di poliacrilamide denaturante• Autoradiografia• Recupero del DNA dal gel. Analisi e clonaggio di DNA genomico eucariotico• Isolamento di DNA genomico eucariotico • Frammentazione del DNA genomico• Dimensione di una libreria genomica• Vettori ad alta capacità usati per librerie genomiche• Screening di una libreria genomica
10. Estrazione e purificazione dell’RNA• Preparazione dei materiali e delle soluzioni utilizzati nelle estrazioni di RNA• Metodi classici di estrazione • Separazione del Poli(A)+RNA
11. Costruzione e analisi di librerie a cDNA• Dimensioni di una libreria di cDNA• Sintesi del primo filamento del cDNA• Sintesi del secondo filamento del cDNA• Clonaggio del cDNA in un vettore• Screening mediante ibridazione di acidi nucleici
12. PCR• Componenti essenziali della PCR• Fasi termiche della PCR • Progettazione dei primer• Problema delle contaminazioni• Hot start • Analisi per elettroforesi su gel• Clonaggio degli ampliconi• Nested PCR• Long PCR • Mutagenesi per PCR• Reverse Transcriptase-PCR (RT-PCR)• Touchdown PCR
13. Sequenziamento• Metodo di Maxam e Gilbert• Metodo di Sanger• Sequenziamento di frammenti di DNA lunghi e di interi genomi
14. Espressione in batteri di una proteina ricombinante
Programma esteso
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Bibliografia
Dai geni ai genomi - Dale, von Schantz - EdiSES
Analisi dei geni e genomi - Richard J.Reece - EdiSES
Ingegneria genetica. Principi e tecniche. S.Primrose et al. - Zanichelli
DNA Ricombinante - J.D.Watson et al. - Zanichelli
Metodi didattici
Lezione orale
Modalità verifica apprendimento
Esame scritto
Altre informazioni
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