Obiettivi formativi
Il corso intende fornire gli strumenti metodologici rivolti alla risoluzione di miscele di proteine e acidi nucleici e alla determinazione qualitativa e quantitativa di specifiche componenti di interesse nella diagnostica alimentare, basati sulle tecniche separative cromatografiche ed elettroforetiche, sulle tecniche di sequenziamento di proteine e DNA e sulle diverse tecniche immunologiche e di biologia molecolare. Sono inoltre descritte le tecniche di biologia molecolare utilizzate per l'ottenimento di organismi transgenici e di proteine ricombinanti di interesse nel settore agro-alimentare. Ampio risalto è dato agli enzimi e alle loro applicazioni analitiche e tecnologiche nell’ambito alimentare.
Prerequisiti
Per una fruizione ottimale del corso, gli studenti dovranno avere solide conoscenze di base di Biochimica.
Contenuti dell'insegnamento
Metodi separativi utilizzati per le proteine. Precipitazione differenziata delle proteine mediante modificazioni di pH, forza ionica e costante dielettrica del mezzo. Tecniche separative cromatografiche per le proteine: cromatografie ad interazione idrofobica, a scambio ionico, ad esclusione dimensionale e di affinità/immunoaffinità. Tecniche separative elettroforetiche per le proteine: elettroforesi su gel di poliacrilammide (SDS-PAGE); focalizzazione isoelettrica; elettroforesi bidimensionale.
Metodologie immunochimiche. Cenni alle basi biochimiche della risposta immunitaria e alle proprietà strutturali/funzionali degli anticorpi. Preparazione di anticorpi policlonali e monoclonali. Utilizzazione degli anticorpi come reagenti analitici: immunoprecipitazione, immunodiffusione, immunoelettroforesi, Western Blotting, test immunoenzimatici (ELISA).
Metodologie di biologia molecolare. Elettroforesi di acidi nucleici. Enzimi impiegati per la manipolazione del DNA: DNA polimerasi, nucleasi, ligasi. Sequenziamento del DNA: metodo della degradazione chimica e metodo a terminazione di catena; sequenziamento a ciclo termico, uso di primer fluorescenti per sequenziamenti automatizzati. Fusione e rinaturazione del DNA. PCR e RT-PCR (reazioni a catena della DNA polimerasi) qualitative e quantitative (real time PCR), RAPD. Enzimi di restrizione e RFLP. Clonazione di geni esogeni, trasformazione di organismi ospiti e selezione dei ricombinanti. Cenni alle metodologie impiegate nella preparazione di organismi transgenici e di proteine ricombinanti di interesse nel settore agro-alimentare. Mais Bt e soia RoundUp ready. Metodi di analisi per la presenza di OGM autorizzati e non autorizzati in prodotti alimentari. Tecnologia antisenso. Animali clonati.
Enzimologia e sue applicazioni. Meccanismo d’azione degli enzimi: principali fattori della catalisi enzimatica. Cinetica enzimatica allo stato stazionario e determinazione di kcat, Km e kcat/Km. Tecnologia degli enzimi. a) Impiego degli enzimi a fini analitici. b) Applicazioni tecnologiche degli enzimi al settore alimentare. Degradazione dell’amido in zuccheri (amilasi e glucosio isomerasi), tecnologie lattiero-casearie (chimosina, proteasi, lipasi, lattasi, lisozima), sintesi di aspartame (termolisina), risoluzione di D- e L-amminoacidi (amminoacilasi). c) Inibitori enzimatici. Inibitori reversibili e irreversibili. Pesticidi come inibitori enzimatici. d) Denaturazione e stabilizzazione degli enzimi. Meccanismo d'azione di agenti chimico-fisici con attività denaturante. Analisi del "folding"/"unfolding" delle proteine mediante l'impiego di tecniche spettroscopiche. Preparazione di enzimi stabili: fissazione covalente e non covalente a supporto. Enzimi da microrganismi termofili.
Basi biochimiche della BSE.
Bibliografia
Wilson K., Walker J. Biochimica e biologia molecolare. Principi e tecniche. Raffaello Cortina Editore
Ninfa A.J., Ballou D.P. Metodologie di base per la biochimica e la biotecnologia. Zanichelli Editore.
Metodi didattici
Lezioni orali mediante l'impiego di mezzi multimediali.
